摘要：为了深入了解疟疾病理过程中TOLL样受体（TLR）和炎症反应的关系，通过Real-time PCR、ELISA等方法，测定了小鼠感染伯氏疟原虫后其TOLL样受体（Toll like receptor，TLR）的mRNA水平和下游炎症因子的血清水平。结果表明，TLR-2、TLR-9、TLR-11的mRNA水平均显著升高，分别为对照的3.0倍、3.5倍和6.0倍。说明宿主通过TLR感知疟原虫的侵入，并启动下游炎症因子的过表达。
关键词：TOLL样受体；Real-time PCR；疟疾；小鼠
中图分类号：R382.3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）15-3589-04
疟疾是一种以雌性按蚊为传播媒介的传染性疾病，主要流行在热带及亚热带地区。在全世界范围内，疟疾每年造成至少150万人的死亡并为许多发展中国家带来沉重的经济负担[1]。在中国北纬25°以南地区，仍有间日疟和恶性疟的流行。中缅及中越边境时有恶性疟原虫的输入病例，并且每年都有因疟疾感染而导致的死亡[2]。近年来，随着氯喹等一线抗疟药物的普遍使用，抗药性疟原虫在非洲及东南亚地区日益普遍，以青蒿素为基础的联合化疗成为治疗疟疾的首选[3]。但是，近年来在非洲已经出现了青蒿素抗性疟原虫，在亚洲的泰国等地甚至出现了青蒿素和氯喹双重抗性的疟原虫[3]。人类在青蒿素之后已经没有任何新的治疗药物或者手段来对抗疟疾了。所以开发新的抗疟药物或治疗方法已成为对抗疟疾的迫切任务。TOLL样受体（Toll-like receptor，TLR）是由Lemaitre等[4]于1996年首次发现。在随后的研究中发现TOLL样受体是机体天然免疫中非常重要的组成部分，在入侵病原突破了机体的机械屏障（如皮肤、黏膜等）后感知入侵病原并随后启动下游的炎症反应。研究表明，TOLL样受体可以感知细菌、真菌、原虫等病原微生物的入侵[5]。2005年，Science杂志报道，小鼠的TLR-11可识别弓形虫的肌动蛋白抑制蛋白样蛋白[6]。而在疟疾感染的进程中，TOLL样受体如何发挥作用尚无明确报道。本研究通过Real-time PCR等方法验证TOLL样受体在疟疾感染小鼠模型的病理进程中其表达量的变化，以探讨TOLL样受体在这一过程中发挥的作用。
1 材料与方法
1.1 动物模型的构建
1.1.1 试验动物 4～6周龄昆明鼠90只，雌雄各半，体重18～22 g，购自新乡医学院动物中心。原生动物门伯氏疟原虫（Plasmodium berghei），购自北京大学医学院寄生虫学教研室。
1.1.2 感染小鼠 初次感染时，取10只小鼠，然后从液氮中取出冻存的伯氏疟原虫（其存在于购得的感染伯氏疟原虫的小鼠外周血中），37 ℃解冻复苏，将血液给每只小鼠腹腔注射0.3 mL。待小鼠外周血被虫体感染的红细胞超过30%后，摘除小鼠眼球取血，并加肝素抗凝。2 500 r/min离心20 min，弃上清液，加入灭菌生理盐水，重新悬浮红细胞，并重复上述步骤，如此反复洗3次后，加入灭菌生理盐水并悬浮红细胞，用于再次感染试验用小鼠。
1.2 肝脏的提取及保存
将感染小鼠麻醉后从眼球或心脏放血，放血后将其断颈，打开其腹腔，取出肝脏用液氮速冻并在液氮中保存。
1.3 血清的提取及保存
将小鼠麻醉后，打开小鼠胸腔，用无菌注射器从小鼠心脏直接抽取心脏血液后加入到灭菌EP管中，37 ℃ 2 h，2 500 r/min离心20 min，取上清液，液氮保存。
1.4 总RNA的提取
1.4.1 小鼠处理方法 取40只小鼠随机平均分为2组，即感染组和对照组，在感染组小鼠经腹腔注射感染伯氏疟原虫后，于1、24、96、144 h分别在2组各取5只小鼠麻醉，取心脏血后将其断颈取其肝脏。取出的血液加入到灭菌EP管中，37 ℃ 2 h，
2 500 r/min离心20 min，取上清液，液氮保存；肝脏用液氮速冻并在液氮中保存。
1.4.2 操作步骤 将试验要使用的枪头、EP管等用DEPC水浸泡至少14 h并高压灭菌，研钵180 ℃干热灭菌4 h。取小鼠肝脏（不超过20 mg）在液氮中研磨成细粉状，加入到裂解液中充分涡旋振荡，之后的步骤按天根试剂公司的动物组织总RNA提取试剂盒说明书进行。提取完成之后再在液氮中冻存。
1.5 反转录PCR过程
1.5.1 反转录反应
1）在微量离心管中加入总RNA 1 μL，Oligo dT 1 μL，轻轻混匀。
2）70 ℃加热5 min，立即将微量离心管插到冰上；然后再加入5×M-MLV Buffer（含dTT） 4 μL，dNTP 1 μL，最后补充适量的DEPC水使总体积达到19.5 μL，轻轻混匀。
3）加入反转录酶M-MLV 0.5 μL；重新置于PCR仪中，42 ℃ 1 h，94 ℃ 5 min，完成反转，将反转产物迅速插冰上，最后放置于-20 ℃保存。
1.5.2 PCR扩增
1）引物序列：针对不同的目的片段TLR-2、TLR-9和TLR-11，引物分别为：
TLR-2引物：上游引物TLR2A 5′-TGGAATGTCACCAGGCTGC-3′，下游引物TLR2B 5′-GTCCGTGGAAATGGTGGC-3′；
TLR-9引物：上游引物TLR9A 5′-TTCTCAAGACGGTGGATCGC-3′，下游引物TLR9B 5′-GCAGAGGGTTGCTTCTCACG-3′；
TLR-11引物：上游引物TLR11A 5′-TCTTTG- ACGCTCGGAACTGTAGCA-3′，下游引物TLR11B 5′-TAGGTCGATGCACAACTGGGTGAA-3′。
以上3对引物的最佳退火温度分别为57.5、59.0、59.0 ℃。
2）PCR反应体系：反应体系50 μL，即无菌水38 μL，10×PCR buffer 5 μL，dNTPs 3 μL，上、下游引物各1 μL，Taq酶1 μL，模板1 μL。
3）PCR反应条件：95 ℃预变性4 min；95 ℃变性30 s，57.5 ℃或59.0 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，30个循环；72 ℃ 延伸7 min，4 ℃结束反应。并对反应产物电泳分析看其是否与扩增目的片段长度吻合。
1.6 连接pMD18-T
将切胶回收的PCR产物4 μL与T Vector 1 μL 65 ℃处理5 min，迅速插到冰上，加入5 μL solution I，16 ℃过夜连接。
1.7 转化DH5α
将连接产物10 μL加入到50 μL DH5α感受态细胞中，冰浴30 min，随后42 ℃热激90 s，迅速插冰上3 min，加入500 μL不含抗生素的液体LB培养基，37 ℃振荡培养1 h，3 000 r/min离心4 min，吸取上清液500 μL，弃去，剩下的液体用枪头吹匀，并涂布在氨苄抗性的固体LB平板上。
1.8 PCR扩增与测序
1.8.1 PCR扩增
1）PCR测序引物设计：模板使用已连接目的基因的T载体。引物使用PCR引物，与上述1.5.2中的引物相同。
2）PCR测序反应体系 ：50 μL反应体系中加入无菌水38 μL，10×PCR buffer 5 μL，dNTPs 3 μL，上、下游引物各1 μL，Taq酶1 μL，模板1 μL。
3）PCR测序反应条件：95 ℃预变性5 min； 94 ℃变性1 min，57 ℃退火 1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸 10 min，每次PCR反应均严格设立阴性对照。
1.8.2 PCR产物纯化及测序 PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，切下扩增片段，用上海华舜生物工程有限公司的小量胶回收纯化试剂盒纯化后直接用于测序。控制区的测序引物直接使用PCR引物。测序反应使用Perkin-Elmer（PE） BigDyeTM Terminator Cycle Sequence Kit进行反应。在96孔PCR板的每一孔中将反应物Kit 2 μL，引物（10 pmol/ μL）1 μL，DNA模板 1～4 μL混合。反应条件根据PE公司建议条件：96 ℃ 10 s，50 ℃ 15 s，25个循环；60 ℃ 4 min。测序反应完成后，进行测序纯化。其步骤如下：
1）将取下的96孔板带膜瞬时离心。撕下盖膜，每孔加入4倍体积的75%异丙醇，振荡混匀后，静置30 min。4 000 r/min离心30 min。将96孔板倒置在吸水纸上，800 r/min离心1 min。
2）加入8倍体积的75%异丙醇，盖好膜后在振荡器上混匀，静置2 min，4 000 r/min离心10 min。将96孔板倒置在另一干净的吸水纸上，900 r/min离心1 min。
3）室温挥发残余异丙醇约10 min，加入30 μL灭菌去离子水，振荡1～2 min，500 r/min瞬时离心1 min，将96孔板上样到测序仪上。测序反应产物经纯化后在ABI3730全自动测序仪上读取序列。测序结果显示所克隆序列与目的序列完全符合。
1.9 实时定量PCR分析
总RNA提取产物在琼脂糖凝胶电泳后检测总RNA质量，并进行反转录，作为实时定量PCR反应的模板，内参照选用小鼠的β-actin基因。再用Takara公司的SYBR？誖 Premix Ex TaqTM试剂盒在ABI Prism 7500 Sequence Detection System上进行PCR反应，反应完毕后使用ABI Prism 7500 Sequence Detection System自带软件进行数据分析。
1.10 ELISA分析
以小鼠血清为材料，稀释20倍后作为模板进行ELISA反应，操作程序以R&D公司说明书为准，反应完毕后在BIO-RAD 680酶标仪上读数，并按要求绘制标准曲线，再根据标准曲线计算各个指标。
1.11 统计学分析
数据以“平均数±标准差”表示，应用SPSS 11.5统计学软件进行单因素方差分析。
2 结果与分析
2.1 TLR-2、TLR-9、TLR-11表达量变化情况
小鼠经腹腔注射伯氏疟原虫之后，其红细胞的感染率在1、24、96和144 h分别为0、6.0%、42.7%和38.2%（图1）。对TLR-2、TLR-9、TLR-11的mRNA水平进行实时定量PCR反应测定后发现，上述3个基因的表达量均有显著升高，其中TLR-2和TLR-9的表达量在96 h时分别为对照组的3.0倍和3.5倍（图2、图3），TLR-11的表达量升高达对照组的6.0倍（图4），与对照组之间差异均达显著水平（P<0.05）。
2.2 疟疾炎症反应过程中主要炎症反应因子的变化情况
将小鼠的血清用灭菌生理盐水稀释20倍后作为模板对疟疾炎症反应过程中的主要炎症因子用ELISA方法进行了测定。结果显示，相比TOLL样受体的变化量，各下游炎症反应因子的变化更为剧烈，可以推断，TOLL样受体在感知了入侵病原伯氏疟原虫之后启动了一系列的下游反应，这些下游反应呈逐级放大的趋势，在反应到达终端的炎症因子（如IL-6、TNF-α、IL-12、IL-18等）时，这种级联反应的效果相当惊人。
ELISA试验结果显示，IL-6 在1 h时为36 U/mL，96 h峰值时升高至10 023 U/mL（图5）；TNF-α在96 h峰值时升高至485 pg/mL（图6），而其基线水平只有20 pg/mL；IL-12在96 h时达到峰值，为186 pg/mL（图7）；IL-18在96 h时其血清水平为3 045 pg/mL（图8）。当TOLL样受体水平和感染率在贫血症状趋于明显开始下降时，这些炎症因子水平也迅速下降，下降的因素包括TOLL样受体水平的降低，也包括在疟疾感染后期各个机体的正常生理机能遭到严重破坏而导致的下降。值得注意的是，在测定的所有炎症因子中，只有IL-18血清水平没有随着感染率和TOLL样受体水平的下降而下降，在96 h之后仍然持续升高，其中的机理还有待进一步的研究。
3 小结与讨论
本研究重点讨论了TLR-2、TLR-9、TLR-11的mRNA水平在伯氏疟原虫侵染小鼠模型过程中表达量变化的规律。其中，TLR-2可以感知疟原虫的磷脂酰肌醇，TLR-9则感知入侵微生物的DNA[7，8]，近期研究也显示人工合成的疟色素通过尾静脉注射给小鼠后，也可通过TLR-9途径启动下游的炎症反应[9]。虽然这一观点尚有争议，一些学者认为疟色素本身没有免疫原性，必须在疟色素表面附着疟原虫的DNA才能有效地启动TLR-9途径[10]。TLR-11在2005年首次报道可以在小鼠体内特异性识别弓形虫的肌动蛋白抑制蛋白样蛋白[6]。而肌动蛋白抑制蛋白在进化上非常保守，从低等生物到高等生物其氨基酸序列的变化非常小。弓形虫和疟原虫同属孢子虫纲生物，所以需要验证在疟原虫侵染过程中TLR-11是否也发挥了一定的作用。我们通过Real-time PCR方法验证了在这一过程中上述3种TOLL样受体表达量变化规律。结果显示，TLR-11的mRNA水平在感染后96 h升高至对照的6.0倍。TLR-2和TLR-9也相应升高至对照的3.0倍和3.5倍。同时发现在TOLL样受体的mRNA水平升高之后其下游的各种炎症因子剧烈升高。这些炎症因子包括IL-6、TNF-α、IL-12、IL-18等。其中IL-12在疟疾的病理过程中发挥着重要的作用，IL-12在TLR-11感知疟原虫的肌动蛋白抑制蛋白之后其在肝脏中的水平迅速升高，从感染疟疾的肝脏中分离出的B细胞甚至具有杀伤正常B细胞的能力[6]。在疟疾的病理进程中，炎症反应是一把双刃剑，在感染的初期，这些炎症因子可以有效地抑制疟原虫的繁殖，同时炎症也是造成疟疾死亡病例的重要因素，包括由于炎症反应导致的血脑屏障通透性改变而产生的脑疟以及后期产生的疟疾性贫血等。
对疟疾病理进程中炎症反应细节的深入了解有助于我们寻找新的药物靶点或新的治疗手段。例如TOLL样受体的抗体或拮抗剂是否有助于在疟疾侵染时适当降低机体的炎症反应水平，降低炎症反应对宿主自身的伤害，从而降低疟疾感染的死亡率等。
参考文献：
[1] NAJERA J A. The control of tropical diseases and socioeconomic development（with special reference to malaria and its control）[J]. Parassitologia，1994，36（1-2）：17-33.
[2] 周水森，汤林华，盛慧锋.2003年全国疟疾形势[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2005，23（6）：385-387.
[3] BURR W. WHO to develop plan to curb artemisinin resistance[J]. CMAJ，2011，183（2）： E81-82.
[4] LEMAITRE B，NICOLAS E，MICHAUT L， et al. The dorsoventral reguLatory gene cassette sp？覿tzle /Toll/cactus controls the potent antifungal response in Drosophila adults[J]. Cell，1996， 86（6）：973-983.
[5] TIPPING P G. Toll-like receptors： the interface between innate and adaptive immunity[J]. J Am Soc Nephrol，2006，17（7）：1769-1771.
[6] YAROVINSKY F， ZHANG D， ANDERSEN J F， et al. TLR11 activation of dendritic cells by a protozoan profilin-like protein[J]. Science， 2005，308（5728）：1626-1629.
[7] HEMMI H， TAKEUCHI O， KAWAI T， et al. A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA[J]. Nature，2000，408（6813）：740-745.
[8] HOEBE K， DU X， GEORGEL P， et al. Identification of Lps2 as a key transducer of MyD88-independent TIR signalling[J]. Nature， 2003，424（6950）：743-748.
[9] GRIFFITH J W， SUN T， MCINTOSH M T， et al. Pure Hemozoin is inflammatory in vivo and activates the NALP3 inflammasome via release of uric acid[J]. J Immunol，2009，183（8）：5208-5220.
[10] PARROCHE P， LAUW F N， GOUTAGNY N， et al. Malaria hemozoin is immunologically inert but radically enhances innate responses by presenting malaria DNA to Toll-like receptor 9[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2007，104（6）：1919-1924.
相关热词搜索： 疟疾 小鼠 受体 模型 感染